Tm ist die Temperatur, bei der die Hälfte des Primers hybridisiert ist; die Annealing-Temperatur ist ein empfohlener PCR-Ausgangspunkt.
Über dieses Tool
Gib eine Primer-Sequenz ein, um ihre Schmelztemperatur (Tm) zu schätzen – die Temperatur, bei der die Hälfte des Duplexes einzelsträngig ist. Die Sequenz wird in Großbuchstaben umgewandelt und auf A, C, G, T und U reduziert, bevor die Basen gezählt werden. Alles wird in deinem Browser berechnet.
Die Basismethode verwendet die Wallace-Regel für kurze Primer (unter 14 Nukleotiden): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Für Primer mit 14 oder mehr Basen wechselt sie zur GC-basierten Formel Tm = 64,9 + 41 × (GC − 16,4) / Länge. Die salzangepasste Methode wendet Tm = 81,5 + 0,41 × GC% − 675 / Länge + 16,6 × log10([Na⁺]) an, wobei die Natriumkonzentration in Millimolar eingegeben wird, um die Pufferbedingungen zu berücksichtigen.
Eine empfohlene Annealing-Temperatur von etwa Tm − 5 °C wird als praktischer Ausgangspunkt für die PCR angegeben, zusammen mit dem GC%-Wert und der Länge des Primers. Zum Beispiel ergibt das 8-mer ATGCATGC (4 A/T und 4 G/C) eine Wallace-Tm von 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Häufig gestellte Fragen
Wann wird die Wallace-Regel verwendet?
Die Basismethode wendet die Wallace-Regel, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), auf Primer an, die kürzer als 14 Nukleotide sind. Bei 14 Basen oder länger verwendet sie stattdessen die genauere GC-basierte Formel.
Was fügt die salzangepasste Methode hinzu?
Sie korrigiert Tm für die Natriumionen-Konzentration des Reaktionspuffers mit einem Log-Term, da höheres Salz den Duplex stabilisiert und die Schmelztemperatur erhöht.
Wie wird die Annealing-Temperatur gewählt?
Eine gängige Faustregel setzt die PCR-Annealing-Temperatur etwa 5 °C unter die Primer-Tm. Es ist ein Ausgangspunkt, den du experimentell optimieren kannst.
Sind diese Werte exakt?
Nein. Dies sind Näherungen ohne Nächste-Nachbar-Modell, nützlich für schnelle Schätzungen. Für kritische Arbeiten verwende ein vollständiges Nächste-Nachbar-Thermodynamikmodell mit deinen genauen Salz- und Primer-Konzentrationen.